A New York, Larry Daley è un padre divorziato che vive di precariato. La situazione poco stabile dell’uomo non giova ai già difficili rapporti col figlio Nick, che ha dieci anni e vive con la madre. Finalmente il giovane trova lavoro come guardiano notturno al Museo di Storia Naturale. Un impiego semplice, a detta dei tre anziani predecessori di Larry, Cecil, Gus e Reginald che stanno per andare in pensione.